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단클론 항체(Monoclonal Antibody)의 여과 생산공정

동물세포와 단클론항체


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단클론항체(Monoclonal Antibody)의 약자인 MAb는 복제된 백혈구의 단일 계통에서 생산되는 항체입니다. 이 항체는 매우 특이적이고 고유한 모세포까지 추적됩니다. 이는 암 및 자가면역 질환과 같은 질병 치료를 포함하여 의학에서 중요한 응용 분야를 가지고 있습니다. 단클론 항체(MAb)는 의학 및 연구에 사용되는 강력한 도구입니다.



단클론항체(Monoclonal Antibody)의 생산


단일클론항체는 단일클론세포에서 생산되는 인공항체입니다. 생산 과정은 일반적으로 골수종 세포를 원하는 항체 생산 비장세포와 융합하여 mAb 생산 세포를 생성하는 것으로 시작됩니다. 이러한 B 세포는 일반적으로 동물, 일반적으로 생쥐에서 공급됩니다. 체세포 혼성화에 의한 B-림프구와 골수종 세포의 융합은 하이브리도마로 알려진 불멸의 세포주인 원하는 항체 생산 요소를 분비합니다. 제조 공정에는 일반적으로 표적 단백질을 발현하기 위해 유전자 변형 유기체를 배양한 후 다운스트림 크로마토그래피 및 여과 단계가 포함됩니다.

단클론 항체 생산-실험실 단계

단클론 항체(mAb), 호르몬 또는 효소와 같은 생물학적 산물은 종종 포유동물 세포(예: CHO 세포 배양)를 통해 생산됩니다. 오늘날 포유류 세포 배양은 많은 생명공학 공정의 핵심 기술입니다. 생물반응기에서 원하는 생성물이 발현된 후, 세포, 세포 잔해 및 불순물을 제거하기 위해 현탁액을 정화합니다. ​

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정화/수확 단계에서는 다양한 접근 방식이 가능합니다. 상업적인 mAb 생산에서는 업스트림 세포 배양을 위한 세포 시스템을 활용한 후 세포 제거 및 단백질 정제를 수행합니다. 원하는 품질의 제품을 얻기 위해 정제 과정에 다양한 크로마토그래피 시스템이 사용됩니다.

​ 공정 및 제품 관련 불순물을 원하는 수준으로 줄여야 합니다. 단백질-A 친화성 크로마토그래피에서 얻은 것과 동일한 품질의 결과를 얻지 못했습니다. 포획의 첫 번째 단계에서 단백질-A 친화성을 사용하는 이점은 항체 분자와의 특이적 결합이 다른 정제 모드로 달성할 수 있는 것보다 불순물 제거 및 회수 과정을 더 효율적으로 만든다는 것입니다

생산공정단계 설명
클론 선택 먼저, 항체를 생성하려는 특정 항원으로 동물(종종 마우스)을 면역화합니다. 이는 해당 항원을 표적으로 하는 항체를 생성하는 B 림프구(면역 세포)의 증식으로 이어집니다. 이들 B 세포는 클론을 형성하며 모두 동일한 특이성의 항체를 생산합니다.
B-림프구의 분리 B-림프구는 면역화된 동물의 비장에서 추출됩니다. 이들 세포는 표적 항원을 인식하고 결합하도록 준비되어 있습니다.
골수종 세포의 분리 한정 증식할 수 있는 골수종 세포를 선별합니다.이 세포에는 두 가지 중요한 특징이 있습니다. 즉, 지속적으로 성장하고 항체 생산이 부족하다는 것입니다.
하이브리도마를 생성하기 위한 융합 B-림프구와 골수종 세포는 융합제(예: 폴리에틸렌 글리콜 또는 결함이 있는 바이러스)를 사용하여 함께 융합됩니다.생성된 하이브리드 세포를 하이브리도마라고 합니다.하이브리도마는 골수종 세포의 불멸의 성장 특성과 B 세포의 항체 분비 능력을 결합합니다.
단일클론 항체 생산 하이브리도마는 배양에서 증식됩니다.각 하이브리도마는 표적 항원에 특이적인 항체를 생산합니다. 이들 동일한 항체는 단클론 항체를 구성합니다.
다운스트림 공정(배양,크로마토그래피,여과) 표적 단백질을 발현하기 위해 유전자 변형 유기체를 생물반응기에서 배양한 후 다운스트림 크로마토그래피 및 여과 단계가 포함됩니다.

단클론 항체 생산-생산공정 업스트림 및 다운스트림


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일반적인 정화 과정에는 1차 정화 단계와 2차 정화 단계가 포함됩니다. 원심분리는 대규모의 경우 가장 일반적인 기술입니다. 잠재적으로 높은 전단력과 서브미크론 입자 제거의 필요성으로 인해 심층 여과(Depth Filtration)는 액체를 하류로 이동하기 전에 필수 단계입니다.

또 다른 옵션은 두 가지 심층 여과 단계를 사용하는 것입니다. 거친 여과와 미세한 여과가 이어집니다. 전통적인 접근 방식 대신 충적 여과를 통해 정화를 수행할 수도 있습니다. 충적 여과의 경우 규조토(DE)와 같은 여과 보조제를 발효액에 직접 첨가하고 몇 분 동안 혼합합니다. 그런 다음 현탁액을 필터를 통해 펌핑합니다. 여과하는 동안 제거할 바이오매스와 DE로 구성된 필터 케이크가 필터 위에 쌓입니다.

문제점


Challenge.png 포유동물 세포주 및 발효 공정의 지속적인 최적화는 더 높은 세포 밀도/역가 및 더 높은 단클론 항체(mAb) 수율로 이어집니다. 이러한 최적화로 인해 바이오매스도 증가하여 정화/수확 단계가 어려워집니다. 그 외에도 일반적인 2단계 명확화 프로세스에는 시간이 많이 걸립니다. 특히 소규모 생산 규모와 생산이 자주 변경되는 제조 현장의 경우 더욱 그렇습니다. 따라서 업계에서는 보다 효율적이고 경제적인 방법이 필요합니다.

세포 포획(Cell Harvesting)을 위한 충적여과(Alluvial Filtration) 솔루션


118.png 발효 공정을 통하여 발생하는 세포 및 세포 찌꺼기를 Centrifuge로 세포수확(Cell Harvesting)을 할 수 있습니다. 그러나 투자비 및 운영비의 측면에서 원심분리기는 그다지 경제적이지 않을 수가 있습니다. 이를 대치할 충적여과방식을 통해서 효율적으로 원심분리기와 동등하게 세포수확을 할 수 있으며 멸균되어 나오는 일회용 충적여과 필터와 필터 보조제를 사용하면 교차오염을 방지할 뿐 만 아니라 간편하게 세포수확을 할 수 있습니다. 일회용 충적여과 필터는 비닐 포장된 Depth 모듈필터는 Filtrox사의 DISSTAR BIO SD 하우징에 장착을 하여 여과를 합니다. 실질적으로 Depth 메디아를 터치하지 않기 때문에 오염이 일어나지 않습니다. 일회용 충적여과는 주로 소규모 스케일의 생산에 적합합니다.

대규모 생산공정에서는 세포포획(Cell Harvesting)을 두 단계로 진행하는 것이 효율적입니다. Centrifuge 와 충적여과의 조합 또는 큰 세포 및 세포 찌꺼기를 수확하는 1차 충적여과와 작은 세포 및 세포 찌꺼기를 수확하는 2차 충적여과 조합입니다. 이때 사용되는 충적여과 필터는 Filtrox사의 PURADISC 필터와 필터 보조제를 사용하는데 PURADISC는 Refine된 Cellulose, 지력증강제, 습윤강화제, 합성섬유 또는 양이온화제를 혼합/반죽하여 자연건조하여 생산하기 때문에 메디아의 강력한 기계적 강도와 균질한 공극분포도를 가지고 있어서 강한 압력과 온도에 견딜 수가 있으며 입자 포획 능력이 탁월합니다.

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세포수확을 위한 충적여과 제품

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정제,농축,탈염을 위한 한외여과(ultrafiltration) 솔루션


121.png 세포 수확(Cell Harvesting) 이후에는 세포와 세포 찌꺼기가 제거된 단클론 항체가 포함된 용액을 한외여과(Ultrafiltration)로 단백질 분자량의 크기에 따라서 분리를 하는 정제(Purification), 정제된 각 분자량의 단백질 중에서 타깃 단백질에 대하여 원하는 만큼의 농도를 얻기 위한 농축(Conentration)과 버퍼 교환을 통하여 원하지 않은 작은 물질을 세척/제거 및 농도를 일정하게 유지하는 탈염(Diafiltration, Buffer Exchange)의 단계를 진행합니다. Membrane Solution 사는 TFF 방식의 한외여과 Hollow Fiber, 정밀여과 Hollow Fiber 및 TFF 방식의 한외여과 카세트를 공급하고 있으며 높은 품질이 검증되어 확실한 정제, 농축 및 탈염을 연구소, 실험실 및 파일럿 스케일에서 진행할 수 있습니다.

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미생물 감소 및 제균을 위한 일반 흐름 여과(NFF)솔루션


121.png 일반 흐름 여과는 카트리지필터와 캡슐필터에서 주로 사용하는 여과 방식으로써 Bio-burden 감소 및 제균 여과용으로 널리 사용됩니다. 제균여과용 필터는 다운스트림의 가장 말단에 위치하고 있으며 모든 미생물을 제거하여 생산제품의 안전성(Safety)을 보장하는 가장 중요한 역할을 합니다. 제균등급필터에 대한 검증은 B. diminuta균을 테스트 필터에 투입시켜서 필터의 하단부로 여과된 용액을 페트리디쉬에 접종하여 배양한 후 균이 한 마리도 발견되지 않으며 제균등급필터라고 합니다. 제균등급필터는 파괴 테스트인 bacterial challenge test와 비파괴 테스트인 Bubble Point 및 Diffusion Flow 완전성 테스트를 진행하여야 합니다. 제균등급필터는 엄격한 국제적 규정에 따라서 제작되어야 하며 GMP 수준의 공장에서 잘 검증된 SOP에 따라서 생산됩니다. Membrane Solutions 사는 이와 같은 모든 규정과 검증 절차에 맞게 최신 시설을 바탕으로 제균등급필터를 생산하고 있습니다.


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